Revista Chapingo. Serie ciencias forestales y del ambiente
Universidad Autónoma Chapingo
rforest@correo.chapingo.mx
ISSN (Versión impresa): 0186-3231
MÉXICO
2008
L.G. Iglesias Andreu / Y. Tivo Fernández
POLIMORFISMO PROTEICO EN PINUS HARTWEGII LINDL. DEL COFRE DE
PEROTE, VERACRUZ, MÉXICO
Revista Chapingo. Serie ciencias forestales y del ambiente,
enero-junio, año/vol. 14,
número 001
Universidad Autónoma Chapingo
Chapingo, México
pp. 5-9
Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal
Universidad Autónoma del Estado de México
http://redalyc.uaemex.mx
5
Revista Chapingo Serie Ciencias Forestales y del Ambiente 14(1): 5-9, 2008.
Recibido: 28 de febrero, 2007
Aceptado: 5 de septiembre, 2007
POLIMORFISMO PROTEICO
EN Pinus hartwegii Lindl.
DEL COFRE DE PEROTE,
VERACRUZ, MÉXICO
L. G. Iglesias Andreu
1
*; Y. Tivo Fernández
2**
1
Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada.
Circuito Los Lagos s/n, Zona Universitaria. C. P. 91090.
Tel. 01 (228) 8 42 27 73. Xalapa, Veracruz, México.
2
Gerencia Estatal de la CONAFOR, Villahermosa, Tabasco, México.
Correo-e: *lgeorg01@hotmail.com; **yamilet84@yahoo.com.mx.
RESUMEN
Se evaluó la composición de globulinas en tejido megagametofítico de semillas colectadas en la población natural de
Pinus hartwegii
ubicada en el Cofre de Perote, Veracruz. Los análisis electroforéticos se realizaron en un sistema discontinuo de geles de poliacrilamida
(PAGE). Los resultados mostraron una buena resolución y repetibilidad en los perfiles de proteínas obtenidos. Se detectó la presencia
de cuatro haplotipos. Los árboles bajo estudio se clasificaron en tres grupos. El grupo I que contuvo la mayoría de los árboles
evaluados (70 %) se caracterizó por presentar el haplotipo I. Estos resultados sugieren la presencia de cierto grado de consanguinidad
en dicha población.
PALABRAS CLAVE: polimorfismo, proteínas,
Pinus hartwegii
, electroforesis, variación.
PROTEIN POLYMORPHISM IN Pinus hartwegii Lindl.
AT COFRE DE PEROTE, VERACRUZ, MÉXICO
ABSTRACT
We evaluate the globulins and total proteins composition in megagametophytes tissue from seeds collected in a natural population of
Pinus hartwegii
located at Cofre de Perote, Veracruz. Electrophoresis was performed in a discontinuous system of polyacrylamide
gels (PAGE). Results shown a good resolution and repeatability in obtained protein profile. It was detected the presence of four
haplotypes. The trees under study were classified in three groups. The group I that contained the majority of evaluated trees (70 %),
was characterized for the presence of haplotype I. Our results suggest the presence of certain inbreeding degree in this population.
KEY WORDS: protein, polymorphism,
Pinus hartwegii
, electrophoresis, variation.
INTRODUCCIÓN
Los ecosistemas forestales mexicanos representan
un valioso recurso biológico a nivel global ya que albergan el
1.3 % de los recursos forestales mundiales (Guevara, 1999).
Sus bosques templados, incluyen entre otros a las coníferas,
que ocupa 15 % del territorio mexicano del cual 90 %
corresponde a bosques de coníferas, representados
principalmente por árboles de género
Pinus
(Vera-Castillo,
2003). Sin embargo, esta diversidad se ha visto en los últimos
años seriamente amenazados debido entre otros factores a
cambios de uso del suelo para actividades de agricultura y
ganadería, incendios, plagas y enfermedades y la tala ilegal
(López
et al
., 1993, Ledig, 2001). Lo anterior ha traído como
consecuencia en el estado de Veracruz, la pérdida de gran
parte de su superficie forestal templada y tropical, con la
consecuente disminución en su diversidad biológica
(SEDARPA, 2006).
Es por ello que la preservación y estudio de la diversidad
genética aún disponible, constituye una tarea de gran
importancia para garantizar un manejo productivo y eficiente
de los ecosistemas naturales. Así mismo, en la
caracterización cuantitativa y cualitativa de esta variación,
se han venido empleando con éxito desde hace años las
6
Poliformismo proteico...
variantes electroforéticas de proteínas en semillas de
diferentes especies forestales (Allona
et al
., 1994; Allona
et
al.
, 1996; Álvarez
et al
., 2004).
La amplia utilización de los marcadores bioquímicos
en la estimación de la variación genética de las poblaciones
forestales se debe en gran medida a las ventajas que las
mismas ofrecen comparada con otras clases de marcadores
genéticos (Iglesias y Casas, 2004). Se ha indicado además
que estos marcadores son neutrales; esto es, no están
ligados a
loci
que afecten el valor de la especie, pueden
resultar muy útiles para conocer la variación presente en
las poblaciones (Gilliland, 1989). Por otro lado pueden ser
resueltas usando las mismas técnicas básicas para la
mayoría de las especies con independencia de su hábitat,
tamaño o longevidad (Hamrick, 1989).
Sin embargo, a pesar de la importancia ecológica y
socioeconómica que posee la especie
P. hartwegii
comúnmente conocida como pino de las alturas, no se
cuenta con suficiente información sobre la variación
bioquímica intrapoblacional existente, que permita contar a
futuro con estrategias apropiadas para la conservación y
manejo adecuado de la misma (Tivo e Iglesias, 2004; Iglesias
y Tivo, 2005). Se conoce sin embargo, que algunas de sus
poblaciones, como la población del Cofre de Perote, en el
estado de Veracruz presenta una seria problemática
reproductiva (Iglesias
et al
., 1999; Iglesias
et al
., 2006). Es
por ello que, considerando todo lo antes expuesto se
emprendió el presente estudio con el objetivo de evaluar el
polimorfismo en la composición de proteínas en
megagametofitos de
P. hartwegii
provenientes de la población
del Cofre de Perote, Veracruz.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para el desarrollo del presente trabajo, se colectaron
muestras de semillas de una población de
P. hartwegii
de
10 árboles seleccionados a partir de su fenotipo, tomando
en cuenta los criterios de inclusión: la rectitud del fuste, la
poda natural, la conformación de la copa y ramas, y que
estuviesen libres de plagas y enfermedades, con base en
caracteres de importancia comercial y a través de la
selección de árboles superiores en los rodales naturales o
plantaciones (Acosta, 1993; CONABIO-PRONARE, 2001).
El sitio de la colecta fue el Parque Nacional del Cofre
de Perote, Veracruz, ubicado en los 19°03’18’’ de latitud
norte y 97°09’34’’ longitud oeste a una altura de 4,282 m
(Servicio Meteorológico Nacional, 1984). La zona se
caracteriza por presentar suelos con una profundidad me-
dia, pedregosos y con poca materia orgánica, precipitación
media anual de 519.1 mm y una temperatura media anual
de 12 ºC (Servicio Metereológico Nacional, 1984).
Las semillas de los árboles en estudio debidamente
identificadas (Ph1, Ph3, Ph4, Ph8, Ph17, Ph18, Ph19, Ph20,
Ph28 y Ph30) fueron almacenadas en refrigeración a 4 ºC
hasta su uso. Las muestras de semilla fueron colocadas en
cajas Petri con agrolita hasta que su radícula alcanzó una
longitud de 3 a 5 mm. En esa fase se procedió a remover la
testa y separar el embrión del tejido megagametofito, para
extraer de éste último las proteínas totales.
Los extractos de megagametofito (M) fueron
homogenizados en frío de acuerdo con la técnica descrita
por Hodgskiss (1998). Los extractos obtenidos se
centrifugaron a 14,000 rpm durante 5 min y posteriormente
se sometió a electroforesis el sobrenadante.
La electroforesis se realizó en un sistema discontinuo
de geles de poliacrilamida (por sus siglas en inglés, PAGE:
Polyacrylamide Gel Electrophoresis) descrito por Davis
(1964) y Ornstein (1964), adaptado a la técnica de lámina
vertical por Chappel
et al
. (1974). Se emplearon geles de 1
mm de grosor, 8.5 % para la zona de separación y 5 % para
la de compactación. En los electrodos se empleó tampón
0.04M Tris-Glicina pH 8.3 (Chappel
et al.,
1974). El corri-
miento se efectuó a 250 mA, durante 5 horas con una fuente
de poder marca Consort (modelo E863). Los geles fueron
teñidos durante 24 h en una solución de ácido tricloacético
al 12 % (p/v) de azul brillante de Coomassie R-250.
Una vez completadas las tinciones se lavaron los geles
varias veces con agua corriente. Para detener la reacción
enzimática y fijar las bandas reveladas, se procedió a
efectuar la destinción de los geles en agua destilada du-
rante 72 horas. Finalmente se agregó a los geles una solución
fijadora de ácido acético al 7 %.
En todos los casos se analizaron seis muestras repe-
tidas por árbol ya que de acuerdo con Conkle (1981), citado
por Ramírez
et al
. (1997), con este tamaño de muestra se
garantiza que la probabilidad de error en la identificación de
individuos heterocigóticos como homocigóticos sea de 0.03.
Los patrones de bandas obtenidos se registraron sobre
la base de número y posición relativa de cada banda detecta-
da; esta última fue establecida al dividir la distancia de migra-
ción recorrida por la proteína entre la distancia total de migra-
ción recorrida por la banda de Kohlraüsch. Posteriormente
se fotografiaron los geles con una cámara digital Cannon
(Zoom Browser EX), sobre un transiluminador de luz blanca.
Sobre la base de la mayor resolución y repetibilidad
observada se seleccionaron algunas bandas, las que fueron
agrupadas en dos zonas electroforéticas de acuerdo a su
movilidad aniónica. Estas se numeraron en orden decreciente
de peso molecular. Dentro de cada una de las zonas
electroforéticas establecidas, se determinó la frecuencia de
cada banda según una escala de tres grados (muy frecuente
>90 % de color negro, relativamente frecuente entre 30 a
90% de color negro con puntos blancos y de poca
frencuencia <30 % de color gris con puntos blancos). A partir
7
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de estos resultados se determinó el porcentaje de
polimorfismo así como la presencia de los perfiles de bandas
(haplotipos) correspondientes.
Con el fin de clasificar a los árboles en estudio sobre
la base de su variación proteica, los datos bioquímicos obteni-
dos se codificaron con los valores 0 y 1 (estados de presen-
cia/ausencia de cada banda), con el fin de procesarlos por
análisis de conglomerado (Sneath y Sokal, 1973). Este último
se realizó mediante el programa STATISTICA (1998) de forma
jerárquica empleándose como índice de disimilitud la distan-
cia de Manhattan y como algoritmo de ligamiento el método
de agrupamiento pareado desbalanceado usando la media
aritmética (por sus siglas en inglés, UPGMA: Unweighted
Pair – Group Method with Arithmetic Averaging) (Sneath y
Sokal, 1973). Además se realizó un análisis de correlación
no paramétrica de Kendall para determinar posibles
relaciones de ligamiento o independencia entre las bandas.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos del análisis de la fracción
proteica correspondiente a las globulinas en las muestras
de megagametofito de cada árbol en estudio, revelaron la
presencia de una buena resolución y repetibilidad en los
perfiles de bandas. Este tejido además resulta muy útil para
evaluar el polimorfismo intrapoblacional considerando lo
indicado por Adams (1983), con relación a que el mismo
posee una estructura genética más simple que la planta
madre (ya que la meiosis ha suprimido en éste la posibilidad
de numerosas interacciones génicas) se facilitan las
interpretaciones genéticas.
Los resultados obtenidos permitieron constatar en pri-
mer término la presencia de proteinogramas caracterizados
por 13 bandas con diferentes intensidades de tinción en te-
jido megagametofítico. Sin embargo, sólo cuatro de ellas,
(con mayor repetibilidad y nitidez), se tomaron en cuenta
para el análisis de la variabilidad intrapoblacional. Las cuatro
electroformas consideradas se encuentran bien delimitadas
en dos regiones electroforéticas: PT1 y PT2 de menor y
mayor movilidad aniónica respectivamente (Figura 1).
La región PT1 se caracterizó por presentar una banda
con valor de movilidad electroforética media de 0.19. Esta
resultó ser polimórfica en dicha población. Por otra parte,
se apreció en la zona PT2 otras tres bandas, una de ellas
fue monomórfica con valor Rf medio de 0.28. Las restantes
bandas (PT3 y PT4), con mayores movilidades aniónicas
(valores Rf medio de 0.32 y 0.45), resultaron ser polimórficas
en este estudio (Figura 1).
Cabe referir que de las tres bandas polimórficas detec-
tadas, sólo dos de ellas (PT1 y PT4) se presentaron en una
frecuencia de 90 %, a diferencia de la banda PT3 que se
presentó sólo en 30 % de los genotipos examinados (Figura
1). A partir de las variantes polimórficas detectadas se pudo
constar la presencia de cuatro perfiles de bandas distintivos;
uno de ellos (haplotipo I) presente con mayor frecuencia (70
%), resultó característica de los árboles: Ph1, Ph3, Ph17,
Ph19, Ph20, Ph28 y Ph30. Los tres perfiles de bandas
restantes (haplotipos II, III y IV) resultaron específicos de
los árboles: Ph4, Ph8 y Ph18, respectivamente (Figura 1).
Por otra parte, el resultado del análisis de conglomerado
efectuado permitió clasificar a los árboles en estudio en tres
grupos (Figura 2). El grupo I estuvo compuesto por siete
árboles (Ph1, Ph3, Ph17, Ph19, Ph20, Ph28 y Ph30), los
cuales mostraron similar perfil de banda (haplotipo I). Los
grupos II y III estuvieron representados cada uno de ellos
por los árboles Ph8 y Ph18 (haplotipos III y IV,
respectivamente) y el árbol Ph4 (haplotipo II).
Los resultados del análisis de correlaciones no
paramétricas realizado (tomando las variantes proteicas
detectadas como variantes), reveló la presencia en algunos
casos de combinaciones más frecuentes de lo que
correspondería si estuvieran al azar, por lo que parece existir
un ligamiento entre los genes que codifican para las bandas
PT1 y PT4 (Cuadro 1).
FIGURA 1. Variación en los proteinogramas de megagametofitos
de ocho árboles de la población de P. hartwegii del
Cofre de Perote, Veracruz. (PTI y PTII: zonas
electroforéticas; I, II, III y IV: haplotipos: >90 %, >30 a
90 % y <30 %. La fecha muestra la dirección de
migración hacia el ánodo).
FIGURA 2. Dendrograma de la clasificación de los árboles de P.
hartwegii en base a su variación de los perfiles de
proteínas totales. Grupos: I, II y III.
8
Poliformismo proteico...
Cabe destacar la utilidad que pudieran brindar las
restantes fracciones proteicas no examinadas para
complementar el estudio de la variabilidad genética en esta
población. Todo lo antes expuesto pudiera explicar la
existencia de una menor variabilidad en los electroferogramas
detectados con relación a lo reportado para la población de
P. hartwegii
del Pico de Orizaba (Solís e Iglesias, 2001).
En
P. pinea
Álvarez
et al.
(2004) detectaron perfiles de bandas
complejos y un elevado nivel de polimorfismo proteico al
analizar 20 poblaciones naturales de esta especie en España.
Por otra parte, la presencia de un porcentaje relati-
vamente elevado de genotipos (70 %) con el mismo perfil de
bandas (haplotipo I) sugiere la existencia de un cierto grado
de consanguinidad en la población. Al respecto cabe
significar que en particular la población de
P. hartwegii
del
Cofre de Perote ha sufrido en los últimos años serias
afectaciones por talas clandestinas e incendios. Según la
SEMARNAT, en 1998 se dañaron 121 hectáreas del volcán
del Cofre de Perote (SEMARNAT, 2001). Todo ello ha
ocasionado una disminución en el tamaño efectivo de la
misma que participa en el mecanismo de la polinización
(Iglesias y Tivo, 2005) y una sensible disminución en la
producción y calidad de sus semillas (Iglesias
et al
., 2006).
Esto pudiera explicar la seria reducción de la tasa
reproductiva observada en esta población. Todo ello, al
parecer constituye manifestaciones del fenómeno de
depresión consanguínea, bastante común en especies de
coníferas (Williams y Savolaienen, 1996). Por otra parte,
estos resultados concuerdan, en general, con los valores
de porcentaje relativamente menos elevado de polimorfismo
detectado al analizar la variación isoenzimática en esta
población (Iglesias y Luna, 2008) con relación a lo obtenido
por Solís e Iglesias (2001), quien detectara una mayor
variación en la composición de esterasas a partir de
megagametofitos colectados en la población de esta especie
ubicada en el Pico de Orizaba.
Otro aspecto que se puso en evidencia en este trabajo,
es que no se observó una clara asociación entre la variabili-
dad genética contemplada en los proteinogramas detectados
con la distribución espacial de los árboles examinados. Los
árboles Ph1 y Ph30 ubicados más distantes en la población
presentaron similitudes en sus perfiles proteicos.
Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que
parece existir relaciones de ligamiento entre los genes que
codifican algunas de las bandas detectadas (PT1 y PT4).
Sin embargo, estudios más amplios que se realicen a fu-
turo en esta población, permitirá contar con marcadores
genéticos útiles que favorezcan el desarrollo de estrategias
apropiadas para la conservación y manejo adecuado, sobre
todo, de aquellas poblaciones que presentan problemas
reproductivos similares a la población del Cofre de Perote.
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variantes polimórficas detectadas.
Variantes electroforéticas PT1
PT3
PT4
PT1
1
0.40 0.55
PT3
0.40
1
0.40
PT4
0.55
0.40 1
Nota: Valores marcados en rojo son significativos con
P
<0.05
9
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